今天為您介紹的是——城市污水管網的規(guī)律
城市污水管網是一個收集、 運輸城市污水的系統(tǒng)，是城市水利基建的重要組成部分[1]. 然而，污水在管網內的運輸過程中水質發(fā)生了變化，生化需氧量(BOD)、 化學需氧量(COD)會有不同程度的變化[2~6]，溶解性有機碳(DOC)也存在著降低的現(xiàn)象[7~9]. 同時，在污水運輸過程中，還發(fā)現(xiàn)管網的管壁上有生物膜的形成[10~12]，由此人們開始關注污水管網中微生物對水質的改變作用.
在城市污水管網中，由于污水中含有揮發(fā)性脂肪酸(VFA)等物質，為產甲烷過程提供了物質基礎[13~15]. 先前研究發(fā)現(xiàn)，在管網中，確實有CH4的產生[16~18]. 管網中CH4的產生對管網的運行管理和污水處理帶來極大的隱患. CH4是一種溫室氣體，管網中的CH4排放到空氣當中會加劇溫室效應[19, 20]; 當管網內CH4濃度超過5%時有爆炸的危險[21, 22]; 管網內CH4的產生會帶走一部分COD，這不利于后續(xù)污水處理廠的生物脫氮除磷的過程[23, 24]，因此管網中CH4的產生是值得關注的問題. CH4的產生與管網中的產甲烷菌有關，因此研究管網中的產甲烷菌也具有重要意義. 然而，目前對管網內產甲烷菌的演替規(guī)律了解甚少.
基于此，本文通過建立一套1 200 m管道系統(tǒng)，對污水管網內CH4沿程變化及產甲烷菌的分布特性進行研究，并探明了產甲烷菌可利用基質與產甲烷菌分布之間的關系.
1 材料與方法
1.1 實驗條件和原水水質
反應器為城市污水模擬管網反應器[25]，以西安市城市污水作為原水，在室溫下運行，實驗溫度為(25±2)℃，pH為7.2±0.3，密封性良好. 管網沿程的溶解氧(DO)為(0.3±0.05)mg ·L-1，沿程變化不大，總體變化趨勢為沿程降低，且由于管網始端和末端暴露在空氣中，溶解氧相對含量較高，溶解氧沿程變化如圖 1所示.
圖 1 管網沿程中溶解氧的變化
在反應器連續(xù)運行期間，通過控制管網坡度為5‰和污水充滿度0.6，來使污水流速為0.6m ·s-1，水力停留時間為1h. 污水依靠重力進入模擬管段. 在反應器連續(xù)運行期間，原水的水質狀況如表 1所示.
表 1 城市污水管網中的水質特性
1.2 取樣方法
在800 m的管網系統(tǒng)中選取8個取樣點，其中選取原水作為0 m處的取樣點，然后一次在分別選取30、 100、 200、 400、 600、 800、 1 000和1 200 m處作為剩余的8個取樣點進行水質分析，分析指標包括COD、 氨氮(NH+4-N)、 總氮(TN)、 總磷(TP)等常規(guī)指標及發(fā)酵產物. 對于生物分析所需要的生物膜樣品采集，以30、 100、 200、 400、 600、 800、 1 000和1 200 m作為生物膜取樣點. 首先將8個位置的管段兩端的活結松開，取下管段，將管段里的有機玻璃條取出，用無菌棉簽將適量的生物膜從有機玻璃載體上刮入一次性培養(yǎng)皿中并將培養(yǎng)皿蓋好，然后立即放入裝有干冰的保溫盒并送至實驗室-20℃保存.
1.3 分析方法
1.3.1 乙酸分析
水樣分析之前用3%的磷酸將水樣的pH調節(jié)到4左右，再將水樣用0.45 μm濾膜過濾. 分析儀器為GC-2014氣相色譜儀(日本島津). 氫火焰離子化檢測器，色譜柱為DB-FFAP(30 m×0.5 μm×0.32 mm). 升溫程序： 初始柱溫100℃保持2 min，以10℃ ·min-1的速度升至120℃保持2 min，再以6℃ ·min-1升至200℃保持2 min. 進樣口溫度200℃，檢測器溫度230℃，進樣量1 μL. N2作為載氣和補償氣，速率均為20mL ·min-1. H2速率為35mL ·min-1，空氣為350mL ·min-1.
1.3.2 甲醇分析
測定甲醇和乙醇的濃度選用方法為氣相色譜法，進樣方式為頂空進樣. 分析儀器為GC-2014氣相色譜儀(日本島津)，色譜柱為CB-5(30 m×0.5 μm×0.32 mm)，F(xiàn)ID檢測器，并配有AOC-5000頂空自動進樣器. 升溫程序： 50℃保持5 min，以5℃ ·min-1的速度升至100℃，保持2 min，以5℃ ·min-1的升溫速度升至200℃. 進樣口溫度為200℃，檢測器溫度為280℃; 載氣流量為5.0mL ·min-1; 分流比2 ∶1. 頂空自動進樣器條件： 加熱平衡溫度為80℃，加熱平衡時間30 min; 取樣針溫度為90℃; 進樣體積1.0 mL.
1.3.3 甲酸分析
分析儀器選用LC2010AHT液相色譜儀(日本島津)，色譜柱為Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)，紫外檢測器，波長設置為210 nm. 流動相為0.02mol ·L-1 KH2PO4 ∶甲醇(體積比為95 ∶5)，用磷酸調節(jié)pH到2. 流速設置為1.0mL ·min-1，柱溫30℃，進樣體積10 μL.
1.3.4 甲胺分析
甲胺濃度采用液相色譜法進行測定. 上機測樣之前對樣品進行PITC衍生化處理，并用C18柱進行固相萃取. 分析儀器選用LC2010AHT液相色譜儀(日本島津)，色譜柱為Hypersil BDS C18(250 mm×4.6 mm×5 μm)，紫外檢測器，波長設置為240 nm. 流動相為乙腈 ∶水(體積比為30 ∶70)，流速設置為1.0mL ·min-1，柱溫30℃，進樣體積10 μL.
1.3.5 CH4分析
CH4的測定選用氣相色譜法，分析儀器為GC-2014氣相色譜儀(日本島津). 檢測器為熱導檢測器(TCD)，色譜柱型號為TDX-01填充柱. 柱溫設置為100℃，保持10 min. N2作為尾氣，流速為10.0mL ·min-1. Ar作為載氣，流速為48mL ·min-1. 使用標準氣體混合氣校準，其組分為37% CO2、 4% N2、 0.802% H2以及CH4.
1.3.6 其他水質分析
實驗中COD、 NH+4-N、 TN和TP的測定采用國家標準方法.
1.3.7 DNA提取和PCR擴增
采用Power Soil DNA提取試劑盒(MO Biomedical,U.S.)對生物膜樣本中的DNA進行提取，提取方法按照試劑盒制造商提供的方法使用說明書進行. 對于產甲烷菌基因片段的擴增，選用特異性引物MLf 5′- GGTGGTGTMGGATTCACACARTA YGCWACAGC-3′和MLr 5′- TTCATTGCRTAGTTW GGRTAGTT- 3′[26]. PCR反應體系(20 μL)： 5×FastPfu Buffer 4 μL，dNTPs 2 μL，引物各0.8 μL，F(xiàn)astPfu聚合酶0.4 μL，模板DNA 10 ng，加無菌水至20 μL. PCR條件： 95℃預變性2 min，95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，25個循環(huán)，比較后72℃延伸5 min. 2%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物.
1.3.8 產甲烷菌454高通量測序
用AeyPrepDNA凝膠回收試劑盒切膠回收PCR產物，Tris-HCl洗脫，并用2%瓊脂糖電泳檢測. 參照電泳初步定量結果，將PCR產物用QuantiFluorTM-ST藍色熒光定量系統(tǒng)(Promega公司)進行檢測定量，之后按照每個樣本的測序要求，進行相應比例的混合. 用Roche GS FLX Titanium emPCR試劑盒對混合物進行emPCR擴增，擴增后的混合物按照454平臺的標準方法，在Roche 454 GS FLX+Titanium平臺上進行上機測序.
2 結果與分析
2.1 管網系統(tǒng)中CH4氣體的產生
圖 2中展現(xiàn)了管網中CH4的含量的變化趨勢，結果表明CH4含量較低均在3%以下，遠小于50%，所以管網內甲烷化程度較低[27]. 從中可以看出，CH4在管網中的變化規(guī)律是沿程增加的. 在0~30 m處，沒有CH4的產生，這可能由于在管網始端，污水中溶解氧含量較高，不適合產甲烷菌富集生長，此外污水中的有機物質以大分子有機物為主，這些大分子有機物質無法被產甲烷菌直接利用. 隨著管網沿程距離的不斷增加，管道內CH4的含量也不斷升高，在1 200 m處達到比較大值，其含量為2.75%. CH4含量沿程升高，這是由于管道內的水解發(fā)酵過程使得大分子物質轉化為VFA(乙酸)等小分子物質，產甲烷菌得以不斷利用乙酸等可利用基質，使得CH4在管網中不斷產生并得到積累，故管網中的CH4含量隨之升高.
圖 2 管網沿程中CH4含量的變化
2.2 管網系統(tǒng)中產甲烷菌的沿程分布特性 2.2.1 管網系統(tǒng)中產甲烷菌的構成及多樣性分布
表 2反映了管網中產甲烷菌的構成及其相對豐度情況，從中可以看出，管網中檢測到的產甲烷菌共有9種，其中甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門中的菌屬、 甲烷桿菌科中的菌屬和古菌門中的菌屬在管網中始終存在.
表 2 管網中產甲烷菌的構成1)/%
圖 3展現(xiàn)了管網沿程產甲烷菌的多樣性變化. Shannon指數(shù)是表征物種多樣性的指標[28]，因此在圖 3中是通過Shannon指數(shù)來反映產甲烷菌的多樣性變化. 由于在管網初始端30 m處的生物膜樣本中沒有生成有效序列，即在30 m處沒有檢測到產甲烷菌，故30 m處不存在產甲烷菌，這可以很好地解釋圖 2中30 m處沒有CH4的生成. 從中可以看出，100~600 m之間Shannon指數(shù)沿程降低，由100 m處的2.7降低至600 m處的1.58，600~800 m處的Shannon指數(shù)保持穩(wěn)定，說明管網800 m之前產甲烷菌的多樣性沿程降低，且在600~800 m之間保持穩(wěn)定; 在管網1 000 m處，Shannon指數(shù)突然升高，此后一直保持穩(wěn)定，Shannon指數(shù)穩(wěn)定在2.2左右，說明管網末端多樣性較為豐富且保持穩(wěn)定.
圖 3 產甲烷菌多樣性在管網中的沿程變化
2.2.2 管網系統(tǒng)中產甲烷菌菌群結構分析
圖 4所示的是產甲烷菌的熱圖分析，是在屬水平下進行的分析，不同的顏色代表了不同的相對豐度值，藍色相對豐度比較低，紅色相對豐度比較高，圖頂?shù)姆种П硎玖藰颖局g的結構相似性. 由于30 m沒有產甲烷菌，因此管網30 m處的樣本不參與熱圖分析. 圖 4中聚類結果表明，管網100~1 200 m中的產甲烷菌群落結構共分為兩大類，其中200~800 m為一類，100、 1 000和1 200 m為一類. 200~800 m這一類中，600 m和800 m中的群落結構比較為相近，而在100、 1 000和1 200 m的這一類中，以1 000 m和1 200 m的群落結構比較為相似; 在800 m和1 000 m這一相鄰位置處，群落結構發(fā)生了明顯的改變，說明在該處存在著產甲烷菌的演替現(xiàn)象. 同時，根據圖中的顏色分布可以看出，在管網中的優(yōu)勢菌群有甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬，其中甲烷八疊球菌屬和廣古菌門中的菌屬為主要優(yōu)勢菌群.
圖 4 產甲烷菌聚類(熱圖)分析
2.2.3 產甲烷菌的菌屬演替過程
優(yōu)勢菌群是一個群落中的主要構成部分，基于1.2.2節(jié)的結果對管網中的優(yōu)勢產甲烷菌進行進一步的分析. 圖 5反映了管網中優(yōu)勢產甲烷菌相對豐度的沿程變化，結果表明，甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬，這3種產甲烷菌相對豐度變化規(guī)律較為明顯. 在管網30 m處，3種菌屬都不存在，在管網100~800 m范圍內，甲烷八疊球菌屬的相對豐度在3種優(yōu)勢菌屬中比較高，且隨著管網距離的增加相對豐度也不斷增加，與之相反，廣古菌門中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬在管網100~800 m的范圍內相對豐度的沿程變化趨勢與甲烷八疊球菌屬嚴格相反，它們的相對豐度在管網中沿程降低，其中甲烷桿菌科中的菌屬在600~800 m之間失去優(yōu)勢地位，相對豐度均在0.7%以下; 在管網1 000~1 200 m范圍內，甲烷八疊球菌屬的相對豐度降低并保持穩(wěn)定，廣古菌門中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬相對豐度升高并保持穩(wěn)定，其中廣古菌門中的菌屬)超過甲烷八疊球菌屬成為3種菌屬中相對豐度比較高的菌屬. 從圖 5中可以看出，600 m和800 m、 1 000 m和1 200 m的優(yōu)勢菌屬的相對豐度變化不大，這與圖 4中的群落結構分析可以很好地對應起來，也說明了群落中的優(yōu)勢菌屬的構成基本反映了群落結構的構成情況. 同時，在800~1 000 m的過程中，3種產甲烷菌的相對豐度、 優(yōu)勢地位和變化趨勢都發(fā)生了改變，說明在該管網范圍內，產甲烷菌群中菌屬發(fā)生了演替過程，即在該處廣古菌門中的菌屬取代了甲烷八疊球菌屬成為優(yōu)勢菌屬.
圖 5 優(yōu)勢產甲烷菌相對豐度在管網中的沿程變化
2.3 產甲烷菌可利用基質的變化規(guī)律
圖 6反映了產甲烷菌可利用基質的變化情況. 管道中存在的產甲烷菌可利用基質有甲酸、 甲醇、 甲胺、 乙酸(“三甲一乙”)和H2，其中乙酸的含量比較高，而甲胺的含量極低. 由于H2是氣相產物且在管網中的含量很低，本文對H2不做過多論述. “三甲一乙”這4種基質在管網中的變化規(guī)律基本一致，均呈現(xiàn)出先增加后降低的變化趨勢.
圖 6 管網中產甲烷菌可以用基質的沿程變化
乙酸在整個管網中含量比較高，在管網0~600 m沿程增加并在600 m處達到比較大值8.67mg ·L-1，并在600~800 m處保持穩(wěn)定，而后開始沿程逐漸下降; 甲酸在管網0~400 m沿程增加并在400 m處達到比較大值3.64mg ·L-1，而后開始沿程降低; 甲醇在30 m處達到比較大值2.17mg ·L-1后開始沿程降低; 而甲胺在整個管網中的含量之中保持在很低的水平且濃度不超過0.015mg ·L-1，在800 m處含量比較高0.011mg ·L-1. 這4種基質在管網中均存在含量降低的現(xiàn)象，說明這4種基質在管網中都被產甲烷菌利用生成CH4. 在管網中，乙酸是含量比較高的產甲烷可利用基質，即產甲烷菌可以利用的乙酸多，且根據厭氧三階段理論，在發(fā)酵產甲烷過程中72%的CH4主要來自于乙酸[29]，說明在管網中產甲烷菌主要利用乙酸. 管網中0~800 m處甲烷八疊球菌屬相對豐度比較高，主要利用乙酸生成CH4[30, 31]，甲烷八疊球菌屬的相對豐度在該范圍內沿程增加，這很好地解釋了在0~800 m乙酸含量的變化情況，且600~800 m乙酸含量保持穩(wěn)定，而甲烷八疊球菌屬的相對豐度也保持穩(wěn)定; 管網800 m處以后，乙酸含量下降，且微生物代謝過程中使得某些中間產物富集，這對甲烷八疊球菌屬而言，環(huán)境開始變得惡劣，這就使得其在該環(huán)境下處于不利的地位，競爭能力下降，從而相對豐度下降，廣古菌門中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬在該環(huán)境下競爭優(yōu)勢增強，相對豐度增加.
3 結論
(1)城市污水管網中生成CH4的量較低，管網中甲烷化程度較低. 在管網初始端沒有CH4的產生，而后隨著管網距離的增加，CH4在管網中呈現(xiàn)出了逐漸增加的變化趨勢.
(2)城市污水管網中產甲烷菌主要包含，甲烷八疊球菌屬、 廣古菌門中的菌屬和甲烷桿菌科中的菌屬這3種. 產甲烷菌的群落結構在800~1 000 m發(fā)生了明顯的改變，在管網該范圍內發(fā)生了廣古菌門中的菌屬取代甲烷八疊球菌屬成為優(yōu)勢菌屬的演替過程.
(3)城市污水管網中產甲烷菌可利用基質“三甲一乙”中乙酸含量比較高，甲胺含量始終維持在極低的水平. 這些物質在管網中均呈現(xiàn)出了先增加后降低的變化趨勢，其中乙酸在600~800 m含量維持穩(wěn)定. 由于不同產甲烷菌屬適應的物質條件和環(huán)境條件不同，因此這些物質條件和環(huán)境條件的改變，使得產甲烷菌在管網中的分布發(fā)生了改變.
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